異硫氰酸胍/氯化銫超速離心法制備 RNA 實(shí)驗(yàn)

材料與儀器

1. 細(xì)胞和組織
細(xì)胞/組織，凍于液氮

2. 緩沖液、溶液和試劑
氯仿
氯化銫溶液，5.7mol/L(5.7mol/L 氯化銫，25 mmol/L 醋酸鈉，pH6.0，1mmol/LEDTA,pH8.0)
用焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的水
二硫蘇糖醇（DTT)，0.2 mmol/L
EDTA,1mmol/L，pH8.0
乙醇，70%(體積分?jǐn)?shù)）
異硫氰酸胍裂解緩沖液 (4mol/L 異硫氰酸胍，25 mmol/L 醋酸鈉，pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)
異丙醇
N-月桂酰肌氨酸，20%（200 g/L)
氯化鋰（LiCl),8mol/L
液氮
β-巰基乙醇,10 ml/L
苯酚, 水飽和，pH4.0
3. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)子
BeckmanTi50 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子
4. 特殊設(shè)備
研缽和杵，用 DEPC 處理過的水洗滌，預(yù)冷
超速離心管（異質(zhì)同晶共聚材料），或相當(dāng)?shù)?/span> Polygon, 或相當(dāng)?shù)母咚賱驖{器

步驟

1、使用研缽和杵在液氮下將樣品研磨成細(xì)粉。使用 Polygon 均化器或其他合適的器具在 7 ml 胍裂解緩沖液中均質(zhì)化組織或細(xì)胞（達(dá) 1X109 個(gè)）。
2、將 4 ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液加到超速離心管中。
3、將 1ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液、120ul10mol/L 的沒-巰基乙醇和 240ulN-月桂酰肌氨酸加到裂解產(chǎn)物中。
4、將氯化銫/裂解產(chǎn)物混合物混合，小心使之位于離心管中的氯化銫溶液上分層。
5、20°C 下 180000 g 離心 21 h。
6、移棄氯化銫上清液，小心避免擾動(dòng)管底的 RNA 沉降物。
7、小心將 RNA 沉降物再溶解于 750ul 異硫氰酸胍裂解緩沖液中。
8、加等體積酚，混勻。
9、10000g 離心 15 min。
10、將水相轉(zhuǎn)移到一新管中。重復(fù)水相的酚抽提，直到界面變清。
11、向清澈的水相加 1 倍體積氯仿。
12、混合，10000 g 離心 l0 min。
13、將水相轉(zhuǎn)移到一干凈試管中。加等體積的異丙酵和 1/10 體積 8mol/L 的氯化鋰。10000g 離心10min。
14、移棄上清液。用 750ul70% 乙醇洗滌 RNA 沉降物，10000 g 離心。
15、移棄乙酵，風(fēng)干沉降物，再溶解于 50~500ul0.2 mmol/L 的 DTT 中。
16、RNA 儲(chǔ)存于-70°C。

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