IPSC培養(yǎng)標準操作流程

更新時間：2026-02-09

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iPSC來源廣泛，具有較強的體外擴增、復制和分化能力、較低的免疫原性、較高的基因編輯效率等。基于這些優(yōu)勢，iPSC技術(shù)已廣泛應用于疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，是個性化細胞治療和再生醫(yī)學研究的重要科學工具。

那么它具體怎么培養(yǎng)呢？

一、IPSC培養(yǎng)之實驗前準備

試劑：預熱的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)基（如mTeSR™ Plus， E8）、基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板、解離試劑（如 Gentle Cell Dissociation Reagent，不含酶）、PBS、ROCK抑制劑（Y-27632）。

設備：37°C， 5% CO?培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺。

二、IPSC培養(yǎng)之基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板

用預冷的PBS或無血清DMEM按說明書比例稀釋基質(zhì)膠。

迅速將稀釋液加入培養(yǎng)板中（6孔板約1 mL/孔），室溫靜置至少1小時或4℃過夜。

使用前吸棄包被液，無需晾干，直接接種細胞。

三、IPSC培養(yǎng)之日常觀察與換液

每日觀察：在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。健康的iPSC克隆應邊界清晰、細胞核大、核質(zhì)比高、克隆內(nèi)細胞排列緊密。邊緣出現(xiàn)扁平、拉長或透明的細胞是分化的征兆。

換液：每天換液一次。輕柔吸棄舊培養(yǎng)基，沿孔壁緩慢加入預溫的新鮮培養(yǎng)基，避免吹打克隆。

四、IPSC培養(yǎng)之傳代（關鍵步驟）

iPSC通常每4-7天傳代一次，當克隆大到開始互相接觸時進行。

方案A：酶解法（EDTA或Accutase）：

1. 吸棄培養(yǎng)基，用PBS輕柔清洗一次。

2. 加入適量含0.5 mM EDTA的PBS或Accutase，37℃孵育3-5分鐘。

3. 在顯微鏡下觀察，當克隆邊緣開始卷起、細胞間隙變大時，迅速吸棄解離液。

4. 加入含10 μM ROCK抑制劑的完全培養(yǎng)基，用1mL移液器輕柔吹打成小團塊（約幾十到幾百個細胞一團）。切忌吹成單細胞！

5. 離心，重懸，按適當比例（通常1:6至1:20）接種到新包被的板上。

方案B：手動挑克隆法：

用于去除分化部分、單克隆篩選或處理珍貴細胞系。

在顯微鏡下用拉細的巴斯德管或?qū)Ｓ锰翎槪锢砉稳∥捶只目寺^(qū)域，轉(zhuǎn)移至新孔。

關鍵點：傳代后24小時內(nèi)，在培養(yǎng)基中加入ROCK抑制劑，可顯著提高克隆形成率和存活率。

五、IPSC培養(yǎng)之凍存與復蘇

凍存：使用適合無血清培養(yǎng)的專用凍存液（如CryoStor® CS10），或含10% DMSO + 30%血清替代物 + 60%基礎培養(yǎng)基的自配凍存液。以小團塊形式凍存。

復蘇：

1. 快速解凍細胞。

2. 用含大量ROCK抑制劑的培養(yǎng)基重懸并接種。

3. 24小時后全量換液為正常培養(yǎng)基。

六、常見問題與對策

問題	可能原因	解決方案
自發(fā)分化率高	傳代過度消化（單細胞過多）、接種密度過低、細胞過密、培養(yǎng)基過期或pH不穩(wěn)定。	優(yōu)化消化時間；提高接種密度；及時傳代；使用新鮮培養(yǎng)基，檢查培養(yǎng)箱CO?濃度。
克隆不生長/死亡	傳代損傷（單細胞化嚴重）、復蘇損傷、ROCK抑制劑未加或失效、基質(zhì)膠包被失效。	傳代時保持細胞團塊；確保使用ROCK抑制劑；驗證基質(zhì)膠活性和包被流程。
細胞形態(tài)不佳（扁平、松散）	開始分化、培養(yǎng)體系不適用、污染（如支原體）。	鏡下標記并刮除分化區(qū)域；檢查培養(yǎng)基和基質(zhì)膠匹配性；進行支原體檢測。
克隆難以吹下	基質(zhì)膠批號差異、消化時間不足、細胞過度生長。	適當延長消化時間或在37℃孵育；嘗試不同批號基質(zhì)膠。

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