賽默飛Lipo3000 轉染試劑的詳細步驟和關鍵注意事項

核心特點： Lipo3000 是陽離子脂質體試劑，其配方中包含專屬的 P3000™ 增強劑，能顯著提高轉染效率，尤其對難轉染細胞和DNA轉染效果出色。其操作是將脂質體與DNA分別稀釋后再混合，簡化了流程。

一、標準轉染步驟（以24孔板為例）

以下步驟可按比例放大或縮小。

 材料準備

- Lipofectamine 3000 試劑

- P3000™ 增強劑（隨試劑盒提供）

- 待轉染的質粒DNA

- Opti-MEM® 或其它無血清培養基（必須使用，不能用wan全培養基或PBS）

- 狀態良好、密度約70-90%的細胞（具體zui-佳密度需根據細胞類型優化）

- 無抗生素的wan全培養基（轉染前后更換）

 實驗前一日：細胞鋪板

將細胞接種于24孔板中，使轉染時細胞密度達到 70-90% 匯合度。使用正常的wan全培養基。

 轉染當日（以每孔計算）

A. 溶液配制（使用前輕輕混勻各試劑，切勿渦旋）

1.  稀釋質粒DNA溶液：

       取一支無菌離心管，加入 50 µL Opti-MEM 培養基。

       加入 0.5 - 1.0 µg 質粒DNA（zui-佳用量需優化）。

       加入 1 µL P3000™ 增強劑。輕輕吹打或輕彈管壁混勻，室溫孵育5分鐘（可選，但推薦）。

2.  稀釋Lipofectamine 3000試劑：

       取另一支無菌離心管，加入 50 µL Opti-MEM 培養基。

       加入 1.5 µL Lipofectamine 3000 試劑。立即輕輕吹打或輕彈混勻（脂質體容易沉降）。室溫靜置 5分鐘。

B. 形成脂質體-DNA復合物

   將 稀釋好的DNA溶液（步驟A1） 全部加入 含有稀釋脂質體的管子（步驟A2） 中。

   輕輕吹打混勻 或 輕彈管壁混勻。切勿渦旋。

   室溫靜置 10-15分鐘，讓復合物穩定形成。溶液可能會輕微渾濁，這是正常現象。

C. 將復合物加入細胞

   將 100 µL 的脂質體-DNA復合物溶液，逐滴均勻地加入到含細胞的孔中。

   輕輕前后左右搖晃培養板，使復合物分布均勻。

   將細胞放回37°C，5% CO?培養箱中繼續培養。

D. 換液與檢測（時間點需優化）

   轉染后4-6小時，觀察細胞狀態。如果脂質體毒性較大，此時應更換為新鮮的wan全培養基（可含抗生素）。

   如果細胞狀態良好，也可不換液繼續培養。

   在轉染后 24-72小時（取決于實驗目的和報告基因）進行蛋白或mRNA水平的檢測。

二、關鍵注意事項與優化建議

1.  細胞狀態至關重要：使用低傳代、生長旺盛的細胞。轉染時細胞必須處于對數生長期。

2.  無血清與無抗生素：配制復合物必須使用 Opti-MEM。轉染前后培養基應不含抗生素，以減少細胞毒性和干擾。

3.  試劑輕柔混勻：Lipofectamine 3000 和形成的復合物都不能渦旋，劇烈操作會破壞脂質體結構。

4.  DNA純度要求高：使用內毒素低、純度高的質粒（OD260/280 ≈ 1.8-2.0）。

5.  比例優化：shou ci實驗必須進行劑量優化。優化兩個變量：

       DNA用量：通常在0.25 µg - 1.5 µg/孔（24孔板）之間測試。

       Lipofectamine 3000 用量：與DNA的比例（µL : µg）通常在 1:1 到 3:1 之間測試（例如，0.5 µg DNA 搭配 0.5 µL， 1.0 µL， 1.5 µL試劑）。

6.  P3000™增強劑：其用量與DNA量成正比（通常為 2 µL/µg DNA），但也可以微調。

7.  陰性對照：務必設置只加脂質體復合物（不含DNA）的對照組，以評估脂質體本身的細胞毒性。

8.  復合物孵育時間：10-15分鐘足夠，過長（如>30分鐘）可能降低效率。

三、簡明步驟總結

1.  鋪板：細胞達70-90%匯合。

2.  配液A：Opti-MEM + DNA + P3000，混勻。

3.  配液B：Opti-MEM + Lipo3000，混勻，靜置5分鐘。

4.  混合：將A加入B，混勻，室溫靜置10-15分鐘。

5.  加樣：將復合物逐滴加入細胞，輕柔混勻。

6.  培養：4-6小時后換液（視情況），繼續培養24-72小時檢測。

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