Trizol法RNA提取的實驗流程和注意事項

　　Trizol是一種酸性試劑，能從細胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解細胞后，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性，有利于保護RNA的完整性；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機相，RNA存在于上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機相中，從而達到分離的目的。簡單來講就是裂解細胞使RNA得以釋放，加之有機溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離，并進一步純化得到RNA的過程。那么你知道Trizol法RNA提取的實驗流程和注意事項是什么嗎？讓我們一起來看看吧！
 

　　1.樣品的制備
 

　　1)細胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細胞的比例加入Trizol試劑(注：一般來講待細胞在六孔板上生長至80%左右時，每孔收集的細胞加1ml Trizol即可)；
 

　　2)組織：按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理，以利于RNA的釋放(注：組織可以先用液氮急凍后研磨處理，也可用勻漿器或者組織研磨器進行處理，但要注意保持低溫，以防RNA降解)；
 

　　室溫裂解5-10min。
 

　　2.氯仿抽提
 

　　每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右，室溫孵育2-3min。2-8℃，12000g離心15min后溶液分為三層，從上到下依次為水相(RNA)、中間層及有機相(DNA、蛋白質(zhì)等)，轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中(注：此步一定要小心謹慎，慢慢吸取，不可觸及中間層，以免RNA被污染)。
 

　　3.異丙醇沉淀
 

　　每1ml Trizol中加入500ul異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫孵育10min，2-8℃，12000g離心10min，得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注：異丙醇最好提前預(yù)冷，維持低溫環(huán)境，以防RNA被降解)。
 

　　4.乙醇洗滌
 

　　棄去上清，加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀，2-8℃，7500g離心5min(注：75%乙醇可以用無水乙醇及無酶水來配制，同樣最好預(yù)冷處理；清洗時動作要輕柔，過于劇烈會導(dǎo)致RNA沉淀散開，再次離心未免會重聚，從而造成RNA的損失)。
 

　　5.溶解
 

　　棄去上清，于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min，用50ul左右的無酶水重懸沉淀，即可得到RNA溶液(注：干燥時間不可過長，太過干燥會導(dǎo)致沉淀很難溶解，部分溶解的RNA的260/280的比值會大大降低，甚至低于1.6；亦可采用金屬浴60℃，5min以助溶)。
 

　　6.RNA質(zhì)量的檢測
 

　　1)微量分光光度計
 

　　純RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小，則代表可能有蛋白或有機溶劑的污染，比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。
 

　　2)瓊脂糖凝膠電泳
 

　　可見三條帶，從上往下一般為28s RNA、18s RNA及5s RNA，一般情況下5s的帶非常淡，甚至看不清，28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍，且不存在拖尾，即可證明RNA純度可以，如若5s很明顯，而28s 與18s帶的亮度并無太大差別，甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解。
 

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