PCR反應(yīng)體系主要是什么？

你知道PCR反應(yīng)體系主要包含那些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、模板（template)

模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒DNA等)或RNA（如總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等），但必須符合兩個(gè)條件：一是純度必須較高，二是濃度不能太高以免抑制。模板是待擴(kuò)增的目的基因或特異片段，如診斷病人是否攜帶有突變基因時(shí)，其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。

二、引物（primers)

人工合成的一對(duì)引物可以分別與兩條模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸序列，其中一條稱為上游引物，另一條稱為下游引物。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。引物濃度一般為0.1~0.5umol/L，濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長(zhǎng)度一般為15~30bp,引物過長(zhǎng)或過短都會(huì)降低特異性。其3'末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G(因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸)。引物GC占45%~55%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。

三、底物(dNTP)

dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)至7.0~7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。一般存儲(chǔ)濃度為10mo/L，各成分以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20~200umol/L，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。多次凍融會(huì)使dNTP降解。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。當(dāng)PCR需要較高濃度的dNTP時(shí)，應(yīng)在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加Mg2+的濃度。

四、DNA聚合酶

PCR所用的酶主要有Taq和Pfu兩種來(lái)源，分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中，Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配：Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以，實(shí)際使用時(shí)必須根據(jù)需要做不同的選擇。目前使用最多的是Taq酶。該酶在92.5℃、95.0℃和97.5℃時(shí)，其半衰期分別為130分鐘、40分鐘和5~6分鐘，可見該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。Taq酶還具有良好的延伸效率，其生物學(xué)活性在75~80℃時(shí)最高，一般用72℃，每一個(gè)酶蛋白分子每秒可延伸約150個(gè)核苷酸。在70℃時(shí)，延伸速率為60個(gè)核苷酸/秒以上。當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，該酶延伸速率明顯下降，可能與引物—模板遭到破壞有關(guān)。其最適pH值為8.3~8.5，能催化以DNA單鏈為模板、以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)、按5'→3'方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3'端、合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈，無(wú)3'→5'的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高，會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0.5~5.0個(gè)單位/100uL。

五、PCR緩沖液(PCR buffer)

緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四種有效成分：①緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；②一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；③二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；④輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu)。

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